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双向电泳第二向操作规程

双向电泳第二向操作规程

 

一、胶条的处理

  1. 配置10%的丙烯酰胺凝胶两块,从-20冰箱中取出的胶条,室温放置10分钟,使其溶解。

  2. 配置胶条平衡缓冲液I

  3. 在桌上先放置干净的厚滤纸,聚焦好的胶条面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MiLiiQ水浸湿,挤去多余的水分,然后直接置于胶条上,轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这样可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。

  4. 将胶条转移至溶涨盘中,每个槽一根胶条,在有胶条的槽中加入5ml胶条平衡缓冲液I。将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。

  5. 配置胶条平衡缓冲液II

  6. 第一次平衡结束后,彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上,以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。再加入胶条平衡缓冲液II,继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。

  7. 第二次平衡结束后,彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II。用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上,以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。

二、配制第二向SDS-PAGE凝胶

  1. 用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上,长玻璃板在下,短玻璃板朝上,凝胶的顶部对着自己。

  2. 将琼脂糖封胶液进行加热溶解。

  3. IPG胶条从样品水化盘中移出,用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸没在1X电泳缓冲液中。然后将胶面朝上放在凝胶长玻璃板上。其余胶条同样操作。

  4. 将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上,短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。

  5. 用镊子、压舌板、或是平头针,轻轻地将胶条向下推,使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针推胶条时,要注意是推动凝胶背面的支撑膜,不要碰到胶面。

  6. 放置5分钟,使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。然后将凝胶转移至电泳槽中。

  7. 在电泳槽中加入电泳缓冲液后,接通电源,起始时用的低电流或低电压,待样品在完全走出IPG胶条,浓缩成一条线后,再加大电流,待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。

三、电泳结束

  1. 电泳结束后,轻轻撬开两层玻璃,取出凝胶,并切角以作记号(戴手套,放置污染胶面)。

  2. 关闭电泳仪。SDS-PAGE进行染色处理。